凱氏定氮法是目前使用最為廣泛、經典的蛋白質含 量測定方法，也是蛋白質檢驗的國家標準方法。該方 法操作簡單，測定結果重復性和重現性好，廣泛應用 于各種食品、飼料、水產等行業的蛋白質含量測定。 蛋白質中含有一定比例的氮元素，氮元素含量與蛋白質 的含量存在一定的轉換關系，即氮換算蛋白質的系數， F[1]。凱氏定氮法首先測定樣品中氮的質量，再乘以F 值即為樣品中的蛋白質質量。 通常情況下，蛋白質含氮量在16% 左右，其 F 值 為6.25。但是，實際上不同來源的蛋白質的氨基酸組成 差別很大，含氮量的差別也很大，如乳制品、面粉、 花生的蛋白質含氮量分別為15.67%、17.54% 和18.32%， 則它們的F 值分別為6.38、5.70 和5.46[1]。

對于魚類蛋 白而言，國家標準中沒有列出其F 值，研究人員普遍 引用肉及肉制品的F 值(6.25)來計算其蛋白質含量。但作 者在研究魚肉蛋白過程中多次發現，按此系數計算所得 的蛋白質含量常常遠高于魚肉酸水解氨基酸的總量，魚 蛋白粉的蛋白含量測定結果往往超過100%。最初作者 認為誤差源自不準確的蛋白質系數(6.25)，所以在現有的 文獻基礎上計算了魚肉蛋白含氮量并推導了F 值，結果 顯示魚肉蛋白含氮量在14% 左右，絕大部分魚蛋白的真 實F 值在7.0～7.5 之間。然而如果根據此系數計算魚肉蛋白質含量則勢必造成計算結果更大的偏離。經初步分 析，筆者判斷該誤差源自魚肉中存在的非氨基酸態氮 (non-amino acid nitrogen，NAN)，如氧化三甲胺及其 分解產物、尿素、生物堿等，它們的存在虛高了魚肉 的蛋白質含量。 為了使凱氏定氮法能夠準確的測定魚肉及魚肉制品 中的蛋白質含量，并客觀、真實的評價魚蛋白質的營養 價值，本文針對氮換算蛋白質系數和如何去除魚肉中非 氨基酸態氮的干擾進行研究，并探討可行的改進措施。
1 凱氏定氮法測定蛋白質的原理
蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和硫酸 銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨 與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用 硼酸吸收后，以硫酸或鹽酸標準滴定液滴定，根據酸 消耗量乘以換算系數，即為蛋白質含量。蛋白質含量 的計算公式如式(1)、 (2)。                (V1 －V2)×c×0.0140×V3 w1/%=——————————————×100    (1)                                   m×V4 w/%= w1×F                                                                 (2) 式中：w 為試樣中蛋白質的含量/(g/100g)；w1 為試樣中氮的質量分數/%；V1 為試樣消耗硫酸或鹽酸標準 滴定液的體積/mL；V2 為試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準 滴定液的體積/mL；V3 為試樣消化液的定容體積/mL； V4 為堿化蒸餾的試樣消化液體積/mL；c 為硫酸或鹽酸 標準滴定液的濃度/(mol/L)；0.0140 為1.0mL 硫酸(c(1/2 H2SO4)=1mol/L)或鹽酸(c(HCl)=1mol/L)標準滴定液相當的 氮的質量/g；m 為試樣的質量/g 或體積/mL；F 為氮換 算為蛋白質的系數：一般食物為6.25，乳制品為6.38， 面粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為 5.95，大豆及其制品為5.71，肉與肉制品為6.25，大米、 小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為5.30。F 值計算方法見公式(3)和(4)[2]。          ∑ N/%=—————×100                                              (3)                ∑Ci F=100/N                                                                            (4) 式中：N 表示蛋白質中總氮含量/%；F 表示氮換算 為蛋白質的系數；C 表示樣品中各氨基酸的百分含量/%； n 表示氨基酸分子中所含氮原子數；W 表示氨基酸的相 Cini Wi×14
對分子質量；14 表示氮原子的相對原子質量；i 取值 1 到 18，表示計算蛋白質氮含量所統計的 18 種氨基 酸。 由式(2)可知，試樣蛋白質含量測定值是否準確只 與兩個因素相關，即試樣氮的質量分數(w1)和氮換算蛋 白質的系數(F)。如要采用凱氏定氮法準確測定試樣的真 實蛋白質含量，則必須已知正確的F 值并測定得出試樣 真實的蛋白質的氮含量(排除非蛋白質氮干擾)。目前國 家標準和水產品行業標準的測定蛋白質的方法(凱氏定氮 法)中都沒有專門為魚類明確標示氮換算蛋白質的系數， 研究人員和水產行業相關從業人員普遍采用肉與肉制品 的換算系數(6.25)。為了改進測定魚及魚肉制品蛋白質含 量的凱氏定氮法，有必要針對蛋白質換算系數和如何去 除魚肉中非氨基酸態氮的干擾展開深入的探討。
2 凱氏定氮法在魚蛋白測定中遇到的問題分析
2.1 魚類氮換算蛋白質的系數 基于文獻報道的40種魚類的肌肉氨基酸分析結果[3-36]， 按照公式(3)計算得到了40 種魚類的氨基酸態氮(aminoacid nitrogen，AN)含量，根據公式(4)推導出了40 種魚 類的F 值(表 1)。由表1 可見，40 種魚的F 值均高于目 前常采用的6.25，除淡水魚魴、羅非魚和瓣結魚F 值在 6.7 左右，淡水石首魚F 值為7.9 外，絕大部分魚類的 F 值在7.0～7.5 之間。
表 2 和表3 統計數據顯示，鯔魚不同部位、軍曹 魚不同生長階段以及文昌魚不同性別對氨基酸態氮含量 (AN)的影響很小，F 值變異系數均小于1%；3 種海水 魚(黃顙魚、石斑魚、鯔魚)在不同生長方式(野生/ 飼養) 下氨基酸態氮含量的變異系數均小于1.5%。表4 所示的 絕大部分海水魚的肌肉和卵的氨基酸態氮含量的變異系 數小于1.5%。由此可見，同一種屬魚類的不同性別、 不同部位、不同組織、不同生長階段、不同生長方式 以及肌肉與卵的氨基酸態氮含量的變異程度很小，F 值 非常接近。由此初步推斷，同一種屬魚類的F 值相對 固定，在凱氏定氮法測定魚類蛋白質含量時，同種屬 魚類采用相同氮換算蛋白質的系數是可行的。 2.2 魚類非氨基酸態氮含量(NAN)分析 如上所述，非氨基酸態氮是凱氏定氮法測定魚蛋白 質的另一主要干擾因素。從表5 和表6 統計數據可見， 魚類的非氨基酸態氮含量(NAN)差異巨大。30 種不同種 屬的魚類(海水魚類和淡水魚類)的非氨基酸態氮的含量差 別在2%～30%，并且同一種屬魚類的非氨基酸態氮含量 的變異性也很大(變異系數多在50% 左右)。雖然統計樣 本量有限，但是由表6 可以看出，同一種屬魚類所處不同育成方式(野生/ 飼養)其非氨基酸態氮含量也會產生明 顯差別；鯔魚不同部位的非氨基酸態氮含量差別很大； 雌雄文昌魚非氨基酸態氮含量也有差別。
鮮活魚類的非氨基酸態氮主要是肌肉內的氧化三甲 胺、尿素、嘌呤和嘧啶堿基、咪唑化合物、胍基化 合物以及甜菜堿類化合物。魚死后貯藏過程中在微生物 和酶的作用下還會分解蛋白質，產生小分子的氨及胺類 化合物使魚體的非氨基酸態氮含量升高，其生成量與魚 體的腐敗程度有相關性[37]。由上述分析可得出一個結 論：不同種屬魚類，或同種屬的魚類(海水魚類或者淡 水魚類)，其非氨基酸態氮含量都存在巨大差異。特別是，魚類還會因為貯藏過程而導致魚體非氨基酸態氮的 含量差異。魚類非氨基酸態氮含量的不確定性為魚肉蛋 白質含量測定帶來了一定的困難。如果要采用凱氏定氮 法準確測定魚肉蛋白質含量，則首先要排除非氨基酸態 氮的干擾。
3 改進措施的探討
鮮活魚類的非氨基酸態氮(氧化三甲胺、尿素、嘌 呤和嘧啶堿基、咪唑化合物、胍基化合物以及甜菜堿 類化合物)和魚死后貯藏過程中在微生物和酶的作用下產 生的氨及胺類化合物具有揮發性，可采用揮發性鹽基氮 的測定方法(GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛生標準 的分析方法》 [38])由凱氏定氮裝置在堿性溶液中將這類堿 性含氮物質蒸餾出來，以硼酸溶液回收。回收的非氨 基酸態氮含量采用凱氏定氮的方法測定，計算非氨基酸 態氮的含量。 因此，可行的凱氏定氮法測定魚類蛋白質含量的公 式為： w/%=(w1－w2)×F                                                        (5) 式中：w 為試樣中蛋白質的含量/%；w1 為試樣中 總氮的含量/%；w2 為試樣中非氨基酸態氮的含量/%； F 為已知的某種魚類的氮換算蛋白質的系數。
4 結  論
通過對30 種魚類中非氨基酸態氮含量的分析，證 實非氨基酸態氮是凱氏定氮法測定魚蛋白質含量的主要 干擾因素。通過對40 種魚類氮換算蛋白質的系數的統計 分析發現當前所普遍采用的F值(6.25)與其真實F值(7.0～ 7.5)相差很大，這給氮換算魚蛋白質含量時帶來了一定 的誤差。本文還簡述了采用揮發性鹽基氮檢測方法測定 魚肉中非氨基酸態氮的措施：在測定的總氮數值基礎上 扣除其非氨基酸態氮含量，再以真實F 值換算魚蛋白質 含量，測定結果將更加可靠。