肌原纖維蛋白是肌肉中的一類重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)群，是由肌球蛋白、肌動球蛋白、肌動蛋白以及調(diào)節(jié)蛋白的原肌球蛋白、肌鈣蛋白等組成的復(fù)合體。肌原纖維蛋白在肌肉蛋白中占50%～55%左右，除了參與肌肉的收縮、影響肌肉的嫩度外，對肉制品品質(zhì)和功能特性有非常重要的影響。肉糜類制品在加工過程中，肌原纖維蛋白受熱形成的凝膠決定了產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)構(gòu)、黏著力及保水性等特性。在不同溫度 [1-3] 、pH值 [4] 、離子強(qiáng)度 [5] 、肌肉類型 [6] 及不同的添加物 [7-8] 條件下，肌原纖維蛋白形成凝膠的能力和特性不同，所表現(xiàn)出的功能特性也不相同。

膳食纖維是不易被消化的食品營養(yǎng)素，根據(jù)溶解性不同可分為水不溶性纖維和水溶性纖維兩大類。膳食纖維單元中含有許多親水性基團(tuán)，有很強(qiáng)的吸水性、持油性、保水性和膨脹性，雖然不能被小腸消化利用，但是可以在人體腸道內(nèi)通過部分或全部發(fā)酵產(chǎn)生降血糖、降膽固醇、促進(jìn)排便、預(yù)防肥胖及消除人體內(nèi)有害物質(zhì)的生理功能 [9-11] 。因此在肉制品中加入膳食纖維，可以部分替代脂肪減少熱量攝入，帶來良好的健康效應(yīng)。此外，如果低脂多纖維肉制品的風(fēng)味和口感能夠為消費者所接受，將會產(chǎn)生巨大的市場價值。小麥麩皮是豐富的膳食纖維來源，其總量占麥麩干物質(zhì)成分的35%～50%，其中大部分為水不溶性膳食纖維。Sánchez-Alonso等 [12-13] 發(fā)現(xiàn)添加量為3%和6%的小麥纖維可以增加魚肉的保水性，且產(chǎn)品的感觀品質(zhì)較好；當(dāng)將其用于魷魚魚糜凝膠中時，其微觀結(jié)構(gòu)顯示麥麩膳食纖維打斷了凝膠連續(xù)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，降低了凝膠的硬度和持水性等凝膠特性，這主要與小麥纖維的粒徑大小有關(guān)，對其感官品質(zhì)無影響。

近些年來，不少國內(nèi)外學(xué)者嘗試將各種來源的膳食纖維添加到肉中用以開發(fā)低脂肉制品 [14-17] ，得到了較好的產(chǎn)品感官特性，但并沒有全面研究膳食纖維對肌原纖維蛋白凝膠及功能性質(zhì)的影響。因此，本課題組在研究豬肉肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)的基礎(chǔ)上，重點探討了小麥麩這種谷物膳食纖維對豬肉肌原纖維蛋白及其凝膠性質(zhì)的影響，以期為促進(jìn)谷物膳食纖維在肉制品加工領(lǐng)域的應(yīng)用提供有意義的借鑒。

1  材料與方法

1.1  材料與試劑

新鮮豬（品種：北京花豬）通脊肉，購于北京市永輝超市。

磷酸鈉、氯化鈉、氯化鎂、六水合氯化鎂、叔丁醇、十二水合磷酸氫二鈉、戊二醛、三氯甲烷/乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙醚（均為分析純）  國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2  儀器與設(shè)備

POLYTRON System PT 2500E型高速勻漿機(jī)  瑞士Kinematica公司；Himac CR 22G型高速冷凍離心機(jī)日本日立公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋  上海一恒科技有限公司；ALC-1100.2型電子天平、TB-214 型分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-3D型pH計上海三信儀表廠；UV-2450型紫外-可見光分光光度計、RF-5301PC型熒光分光光度計  日本島津公司；S53/54型紫外-可見分光光度計  上海棱光技術(shù)有限公司；CT3型 Texture Analyzer質(zhì)構(gòu)儀  美國博勒飛公司；Sigma3k15型離心機(jī)  美國Sigma公司；DCW-3506型低溫恒溫槽  浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；TESCAN VEGA Ⅱ掃描電子顯微鏡  捷克帝肯公司；Kinexus型超級旋轉(zhuǎn)流變儀、Mastersizer激光粒度分析儀英國馬爾文儀器有限公司；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵

河南鄭州長城科工貿(mào)有限公司；WZJ6（BFM6）型振動式超微粉碎機(jī)  山東濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司ALPHA 1-2 LD Plus冷凍干燥機(jī)  德國Christ公司；7620離子濺射鍍膜儀  美國Electron Microscopy Sciences公司。

1.3  方法

1.3.1  豬肉肌原纖維蛋白的提取

參考Liu Gang等 [18] 的方法，并做了部分改進(jìn)。將新鮮豬通脊肉絞成肉餡，加入4 倍體積提取液（10 mmol/LNa 3 PO 4 、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl 2 和1 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙醚，pH 7.0），攪勻，用高速勻漿機(jī)勻漿5 min，2 000×g、4 ℃離心15 min，倒掉上清液，收集沉淀，重復(fù)勻漿離心提取3 次，得到肌原纖維蛋白粗提樣品，在粗提肌原纖維蛋白沉淀中加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，高速勻漿5 min，1 層紗布過濾（紗布提前在沸水中煮20 min），3 000×g、4 ℃離心15 min，取沉淀，加4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，勻漿5 min，重復(fù)提取兩遍得到的沉淀，即為提純的肌原纖維蛋白，在4 ℃條件下冷藏備用。

1.3.2  肌原纖維蛋白質(zhì)成分分析

參照郭堯君 [19] 和Laemmli [20] 等的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）不連續(xù)電泳方法，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）法對肌原纖維蛋白進(jìn)行電泳分析。

1.3.3  肌原纖維蛋白濁度的測定

參考Benjakul等 [21] 方法測定肌原纖維蛋白的濁度。以不含蛋白的溶液為空白對照組，由于吸光度越大，濁度越大，因此在600 nm波長處測定吸光度，研究不同溫度對肌原纖維蛋白濁度的影響。

1.3.4  肌原纖維蛋白凝膠及膳食纖維混合凝膠的制備參考徐幸蓮 [22] 和朱君 [23] 等的凝膠制備方法，每次實驗前將凝膠放在室溫條件下平衡30 min。

1.3.5  肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的測定

取平衡好的凝膠放在載物臺上，利用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測

定，每個凝膠樣品做6 個平行實驗。壓縮模式下測定凝膠

的硬度，質(zhì)構(gòu)儀測定設(shè)置參數(shù)如下：測定模式選擇下壓

目標(biāo)值為4 mm，測試速率為0.5 mm/s，引發(fā)力為4.5 g，

探頭型號選擇TA 10 。

1.3.6  不同因素下肌原纖維蛋白凝膠硬度的測定

測定不同質(zhì)量濃度（20、30、40、50、60、70、80 mg/mL）、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、離子強(qiáng)度（NaCl濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mol/L）、膳食纖維粒徑（未分級、過100、150、200、300 目篩）條件下肌原纖維蛋白凝膠硬度，觀察其變化。

1.3.7  肌原纖維蛋白凝膠保水性的測定

采用Kocher法 [24] 并部分改進(jìn)。測量前將肌原纖維蛋白（混合）凝膠在室溫條件下放置30 min，取45 g不同的凝膠樣品加入50 mL離心管中稱質(zhì)量，記為m 1 /g；3 000×g離心15 min，倒出離心出的水分，再次稱質(zhì)量，記為m 2 /g；空離心管質(zhì)量為m 0 /g。凝膠保水性按式（1）計算。.3.8  小麥麩膳食纖維的提取、粉碎和分級小麥麩膳食纖維的提取參考Bunzel等 [25] 的方法，膳食纖維純度測定參考GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纖維的測定》 [26] 。

小麥麩膳食纖維粉碎分級：取200 g膳食纖維加入超微粉碎機(jī)中，間歇性粉碎3 次，每次粉碎時間持續(xù)10 min。粉碎后將膳食纖維分別過100、150、200、300 目篩。收集過篩后的產(chǎn)物，對膳食纖維進(jìn)行分級。膳食纖維粒徑測定：使用Mastersizer激光粒度分析儀濕法測定樣品的粒度分布。

1.3.9  肌原纖維蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

在Pearce濁度法 [27] 的基礎(chǔ)上稍作改動，測定乳化性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsionstability index，ESI）。取2 mL的玉米油和8 mL的肌原纖維蛋白樣品溶液（蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL），置于直徑50 mL的離心管中，用高速勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，轉(zhuǎn)速約10 000 r/min。勻漿后立即從距離管底0.5 cm處吸取50 μL新鮮的乳化液分散到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液中，以0.1%SDS為空白，在500 nm波長處測量其吸光度A 0 。靜置10 min后再次從相同位置吸取50 μL的乳化液，以上述方法測量乳化液此時吸光度A 10 ，每個樣品做3 次重復(fù)，EAI、ESI分別按式（2）、（3）計算。

EAI/?m 2 /gA 500 nm 2?2.303ρ??1?φ??10 4（2）ESI/%＝ ?100A 10A 0（3）式中：φ為油相體積分?jǐn)?shù)（φ＝20%）；ρ為肌纖維蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.10  肌原纖維蛋白混合凝膠流變性的測定

參考Ramirez-Suarez等 [28] 方法，肌原纖維蛋白和膳食纖維樣品混合物在升溫過程中產(chǎn)生的凝膠力學(xué)變化由蛋白變性所引起，測定模式為正弦振蕩模式，將樣品放在直徑為40 mm的平板夾具之間，兩平板之間間隔為1 mm，清理除去平板周圍多余的樣品，樣品用硅油密封后，蓋上蓋子，從25 ℃開始以1 ℃/min的升溫速率升至80 ℃，最大應(yīng)變?yōu)?.02，固定頻率為0.1 Hz，凝膠的彈性模量為G’，作為評價凝膠黏彈性能的指標(biāo)。

1.3.11  肌原纖維蛋白混合凝膠微觀結(jié)構(gòu)的測定

參考Pan等 [29] 的方法觀察肌原纖維蛋白混合凝膠微觀結(jié)構(gòu)。將制備好的肌原纖維蛋白和膳食纖維混合凝膠樣品切成2 mm×3 mm×3 mm的小塊，用pH 6.8、2.5 g/100 mL的戊二醛溶液浸泡過夜，然后用pH 7.2、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌30 min，反復(fù)洗滌3 次然后用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、80%、90%的乙醇依次進(jìn)行脫水，每次30 min，最后用100%乙醇脫水30 min，反復(fù)脫水3 次。然后用氯仿脫脂1 h，最后用V（100%乙醇）∶V（叔丁醇）＝1∶1的混合液置換30 min。然后用冷凍干燥機(jī)對樣品進(jìn)行干燥。干燥后將凝膠樣品斷開使斷面朝

上，不同樣品黏在不同的載物臺上，并做標(biāo)記，然后用EMS 7620離子濺射鍍膜儀進(jìn)行噴金，觀察處理好的樣品，每個樣品做3 組平行實驗。

1.4  數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每組實驗除特殊說明外均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為采用Microsoft Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysisof variance，ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異顯著，用Origin 8.6軟件對流變性數(shù)據(jù)作圖。

2  結(jié)果與分析

2.1  豬肉肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)分析

2.1.1  肌原纖維蛋白成分分析

肌原纖維蛋白是由幾種蛋白組成的混合蛋白，其中肌球蛋白是最重要的一種蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量大約為480 kD，由2 條重鏈（約200 kD）和4 條輕鏈（16～25 kD）組成，還包括肌動蛋白（單體約43 kD）、肌鈣蛋白（3 個亞基約37、23、18 kD）、原肌球蛋白（2×35 kD）和其他一些功能不明的調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) [30-31] 。其中肌球蛋白對于凝膠的形成有重要作用。由圖1電泳結(jié)果推測，200、43、37、23、18 kD處的蛋白條帶依次可能為肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、肌鈣蛋白，其中肌球蛋白輕鏈需要用5,5’-二硫雙（2-硝基苯甲酸）或在堿性（pH 11.4）條件下處理后才能分離，電泳圖未能觀察到，而原肌球蛋白也可能和肌動蛋白結(jié)合未能分離。圖1肌球蛋白重鏈條帶色澤深且寬，說明該蛋白質(zhì)含量高。提取的肌原纖維蛋白可以用于后續(xù)研究。

2.1.2  不同溫度對肌原纖維蛋白濁度的影響

濁度大小反映蛋白質(zhì)的凝聚程度，以及蛋白質(zhì)溶液中懸浮顆粒的數(shù)量和大小 [32] 。蛋白質(zhì)分散時，顆粒間沒有發(fā)生凝聚，顆粒直徑較小，濁度小；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)凝聚時，懸浮顆粒直徑變大，濁度升高。在濁度變化較大的溫度范圍，肌原纖維蛋白顆粒大量聚集，變性程度也較嚴(yán)重。由圖2可知，隨著溫度升高，濁度升高。在30～40 ℃時濁度變化不大，從40 ℃開始濁度升高，在40～70 ℃變化比較大，70 ℃時濁度達(dá)到最大。在40～70℃時濁度變化比較大，說明此時蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白分子交聯(lián)作用加大，濁度升高。90 ℃時濁度下降，原因是蛋白質(zhì)迅速變性聚沉。

2.1.3  肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對其凝膠保水性和硬度的影響

由圖3可知，肌原纖維蛋白凝膠硬度隨肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的增加而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為70 mg/mL時硬度達(dá)到最大。這是由于隨著肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度增加，蛋白質(zhì)分子間的距離變小，蛋白質(zhì)分子之間凝集的機(jī)會增加，參與凝膠分子數(shù)量增加。當(dāng)肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度為80 mg/mL時，凝膠硬度減小，可能原因是蛋白質(zhì)量濃度大，蛋白質(zhì)分子不能充分展開，形成凝膠網(wǎng)絡(luò)受影響。

當(dāng)肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度小于50 mg/mL時，凝膠保水性隨蛋白質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度達(dá)到50 mg/mL時凝膠保水性趨于穩(wěn)定。高密度的蛋白質(zhì)形成的肌原纖維蛋白相互交織形成了非常緊密穩(wěn)定的立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) [33] 。因此，凝膠保水性隨之升高。綜合考慮，選擇60 mg/mL作為后續(xù)研究的蛋白質(zhì)量濃度。

2.1.4  pH值對肌原纖維蛋白凝膠保水性和硬度的影響

由圖4可知，在pH 5.5時MP凝膠硬度最大，可能是因為此時是蛋白質(zhì)等電點，蛋白間靜電斥力較弱，蛋白質(zhì)分子間的吸引相互作用增強(qiáng)，所以形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，蛋白凝聚在一起，形成的凝膠硬度很大，在中性條件下，由于肌原纖維蛋白的靜電斥力大于在酸性條件下的靜電斥力，從而使蛋白-蛋白間的作用降低，凝膠硬度變小 [34] 。凝膠保水性隨pH值升高而增大，在pH 7.0時，增長平緩，上升幅度變小。當(dāng)pH 5.5時，接近肌原纖維蛋白質(zhì)等電點，蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合作用較強(qiáng)，蛋白質(zhì)與水的作用較弱，因此凝膠保水力較低。隨著pH值升高，偏離肌原纖維蛋白質(zhì)等電點，蛋白側(cè)鏈基團(tuán)的凈負(fù)電荷數(shù)增加，分子間的排斥作用變大，同時凈電荷的增加為環(huán)境中的水分子提供更多的氫鍵結(jié)合位點，增大了水合作用表面積，凝膠保水性提高 [35-36] 。

2.1.5  離子強(qiáng)度對肌原纖維蛋白凝膠保水性和硬度的影響

2.2  小麥麩膳食纖維添加量對豬肉肌原纖維蛋白凝膠功能性質(zhì)的影響

2.2.1  小麥麩膳食纖維添加量對肌原纖維蛋白凝膠EAI和ESI的影響

采用GB/T 5009.88—2008方法可測得小麥麩膳食纖維總含量為40.15%，純度為80.85%。小麥麩膳食纖維添加量對肌原纖維蛋白EAI和ESI的影響如圖6所示。

2.2.2  小麥麩膳食纖維添加量對肌原纖維蛋白凝膠硬度和保水性的影響

2.2.3  小麥麩膳食纖維添加量對肌原纖維蛋白凝膠流變性的影響

2.2.4  小麥麩膳食纖維添加量對肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

2.3  小麥麩膳食纖維粒徑大小對肌原纖維蛋白凝膠功能特性的影響

2.3.1  小麥麩膳食纖維超微粉碎粒徑

由前期實驗結(jié)果可知，小麥麩膳食纖維更有利于肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，而且添加了小麥麩膳食纖維后凝膠硬度和保水性有了提高，但是凝膠容易崩潰，黏聚性比較低。為了改善這種不利狀況，對小麥麩膳食纖維進(jìn)行了粉碎分級，探索不同粒徑小麥麩膳食纖維對肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)的影響。表1為小麥麩膳食纖維經(jīng)超微粉碎后過100、150、200、300 目篩的樣品粒徑測定結(jié)果。

2.3.2  不同粒徑小麥麩膳食纖維對肌原纖維蛋白凝膠硬度和保水性的影響

樣品中肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度為60 mg/mL，膳食纖維添加量為3%時，由圖10可知，隨著膳食纖維粒徑的減小，肌原纖維蛋白凝膠硬度逐漸變大，這是因為膳食纖維粒徑越小，凝膠結(jié)構(gòu)越致密（圖9），凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越好，因此，凝膠硬度越大。肌原纖維蛋白凝膠保水性隨膳食纖維粒徑的減小而增大，這是因為膳食纖維粒徑越小，保水性越好，并且膳食纖維肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)致密性、連續(xù)性越好，越可以保留住更多的游離水。

3

結(jié) 論

利用單因素分析法，研究了肌肉中的重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)群——肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的性質(zhì)，分析了肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度、pH值、離子強(qiáng)度對肌原纖維蛋白凝膠硬度和保水性的影響，并通過添加不同粒徑的小麥麩膳食纖維構(gòu)成混合凝膠，探討了小麥麩膳食纖維對肌原纖維蛋白凝膠硬度、保水性、流變性、微觀結(jié)構(gòu)及質(zhì)構(gòu)特性的變化，主要研究結(jié)果如下：

溫度對肌原纖維蛋白濁度的影響結(jié)果表明肌原纖維蛋白變性聚集的溫度范圍為40～70 ℃。肌原纖維蛋白凝膠硬度和保水性隨肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度增加而增大，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度達(dá)到70 mg/mL時，肌原纖維蛋白凝膠硬度和保水性不再增加；當(dāng)pH值為5.5時，肌原纖維蛋白凝膠硬度達(dá)到最大，凝膠保水性在pH 7.0時開始趨于穩(wěn)定；當(dāng)離子強(qiáng)度為0.6 mol/L時，肌原纖維蛋白凝膠的硬度和保水性趨于穩(wěn)定。

小麥麩膳食纖維添加使肌原纖維蛋白凝膠EAI升高，ESI降低；小麥麩膳食纖維添加量增加使得肌原纖維蛋白凝膠的彈性模量增大、蛋白凝膠硬度和保水性逐漸升高；并且隨著膳食纖維粒徑的減小，凝膠硬度和保水性進(jìn)一步增加；對凝膠網(wǎng)絡(luò)的支撐作用小，蛋白的彈性模量增量降低。通過電子顯微鏡觀察小麥麩膳食纖維添加對豬肉肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響，粒徑較小的膳食纖維充填于交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之中，支撐網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成了更致密、均勾的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，此時凝膠保水性更好，且不會出現(xiàn)崩潰現(xiàn)象，凝膠黏聚性也比較好。

目前膳食纖維添加到肉制品中的商業(yè)化產(chǎn)品市面上鮮有，主要是由于膳食纖維添加量過高易引起產(chǎn)品離散崩潰且口感較差，而膳食纖維添加量少又很難滿足人們期望的健康低熱量需求。因此，可以在實際生產(chǎn)應(yīng)用中通過降低膳食纖維的粒徑、增大添加量，從而改良肉制品品質(zhì)，減少脂肪攝入量，達(dá)到促進(jìn)人體健康的目的，為功能性肉制品及新產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的依據(jù)及參考價值。