蛋白質含量是人血白蛋白質量評價的重要指 標。不確定度是與測量結果相關聯的參數,表征合 理地賦予被測量值的分散性。本文對凱氏定氮法測 定人血白蛋白中蛋白質含量的不確定度來源和大小 進行分析和評價,并初步探討在運用該方法的過程 中應注意的問題,旨在為人血白蛋白以及食品( 尤 其是乳制品) 中的蛋白質含量測定提供一定參考。 　實驗材料及條件

1. 1　儀器及試藥 儀器: 自動定氮儀(Ge r h a r d tVa p o de s t 30 Di g e s t S y s t e m); 玻璃儀器( 1、2、10 mL移液管; 20、100 mL 容量瓶; 25 mL酸式滴定管) , 20 ℃下校準。
試藥: 人血白蛋白( 貴陽黔峰生物制品有限公 司生產,批號為 20070830,規格為 20%, 10 g); 0. 005 mo l ·L -1硫酸滴定液 ( 本所化學室標定 ); 10%鎢酸鈉溶液; 0. 33 mo l ·L -1 硫酸溶液; 2%硼酸 溶液; 40%氫氧化鈉溶液; 甲基紅溴甲酚綠混合指 示液; 98%硫酸; 無水硫酸鈉; 硫酸銅。

1. 2　實驗室環境 溫度變化范圍: ( 20±4)℃。 　

方法

2. 1　試驗過程 按照中國藥典 2005年版三部[ 1 ] 的規定,測定人 血白蛋白中的蛋白質含量,過程見圖 1。2. 2　建立數學模型 人血白蛋白中蛋白質含量 W的計算公式為:
W(%)=C PN×6. 25×1/10×1/20×r e p×100% 其中, C P N=C TN– C NPN

C T N=(V T 4– V 0) ×(V T 1 / V T 2) ×0. 140 1 ×C D/0. 005 × (V D 1 /V D 2)/V T 3 C NPN=(V N4– V 0)×(V N1/ V N 2)×0. 140 1 ×C D/0. 005 × (V D1/ V D2) / V N 3 r e p為總重復性因子。 以 y 表示 W , x i 表示第 i 個影響參數,得 y的合 成標準不確定度為: u c(y )= ∑ n i =1c 2 iu 2(x i )= ∑∑ n i=1u 2(y , x i ) 其中 c i 為靈敏系數,記為偏導 y / x ;u (y , x i) 為由 x i 不確 定度引起的 y的不確定度。 　不確定度的來源及分析

3. 1　不確定度的來源 從人血白蛋白中蛋白質含量測定流程圖來看,凱 氏定氮法測定蛋白含量的不確定度主要來源于 9個 方面: 1) 試驗重復性; 2) 標定硫酸滴定液濃度; 3) 稀釋 硫酸滴定液; 4) 測定總氮稀釋樣品; 5) 滴定總氮吸取 樣品; 6) 滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的體積; 7) 測 定非蛋白氮稀釋樣品; 8) 滴定非蛋白氮吸取樣品; 9) 滴定非蛋白氮實際消耗硫酸滴定液的體積。

3. 2　不確定度 u (x i) 的量化分析

3. 2. 1　由試驗重復性引入的標準不確定度 u (r e p ) 按藥典標準對人血白蛋白樣品平行測定 6次,結 果見表 1。 定規程》查得, A級 10. 0 mL移液管和 A級 100 mL 容量瓶的允許偏差分別為 ±0. 02和 ±0. 10 mL [2] , 近似于三角形分布 [ 3] , 換算成校準不確定度分別 為: 0. 02/60. 5 =0. 008 2 mL , 0. 10/60. 5 =0. 041 mL 。 該容量瓶和移液管均在 20 ℃校準。本實驗室溫 度變化范圍為( 20 ± 4)℃,近似于矩形分布。水的膨 脹系數為 2. 1 × 10 4。換算成溫度不確定度分別為: ( 10. 0×2. 1×10-4 ×4)/30.5 =0. 0048 mL ( 100×2. 1×10-4 ×4) /30. 5 =0. 048 mL 由上述不確定度分量合成得: u(V D1)=( 0. 008 22 +0. 004 82) 0. 5 =0. 009 5 mL u(V D2)=( 0. 0412 +0. 048 2) 0. 5 =0. 064 mL u(V D1/ V D 2)= [( 0. 009 5/10. 0) 2 +( 0. 064/100) 2] 0. 5 ×0. 1 =0. 000 11

3. 2. 4　測定總氮稀釋樣品(V T 1 /V T 2) 引入的不確定 度 u(V T 1/ V T 2) 由《常用玻璃量器檢定規程》可知, A級 1. 0 mL 移液管和 A級 20 mL容量瓶的允許偏差分別為 ±0. 007和 ±0. 02 mL [ 2] ,近似于三角形分布[ 3] ,換 算成校準不確定度分別為: 0. 007/60. 5 =0. 0029 mL 0. 02/60. 5 =0. 008 2 mL 換算成溫度不確定度分別為: 1. 0×2. 1×10-4 ×4/3 0. 5 =0. 000 48 mL 20×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 0097 mL 由上述不確定度分量合成得: u(V T 1)=( 0. 00292 +0. 00048 2) 0. 5 =0. 002 9mL u(V T 2)=( 0. 00822 +0. 00972) 0. 5 =0. 0127 mL u(V T 1 /V T 2)= [( 0. 002 9/1. 0) 2 +( 0. 012 7/20) 2] 0.5 ×0. 05 =0. 000 15

3. 2. 5　滴定總氮吸取樣品( V T 3) 引入的不確定度 u ( V T 3) 與“3. 2. 4”項相同, A級 1. 0 mL移液管的的校準 不確定度為 0. 0029 mL ,溫度不確定度為0. 00048 mL 。 由上述不確定度分量合成得: u(V T 3)=( 0. 00292 +0. 00048 2) 0. 5 =0. 002 9mL

3. 2. 6　滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的體積 (V T 4 -V 0) 引入的不確定度 u(V T 4 -V 0) 1) 肉眼判斷終點所引入的不確定度已包含在 測量重復性引入的標準不確定度 u (r e p ) 中,此處不 再考慮; 2) 滴定管引入的標準不確定度: 由《常用玻 璃量器檢定規程》可知, 25. 0 mL的 A級滴定管其最 大容量的允許偏差為 ±0. 04 mL [2] ,近似于三角形 分布[ 3] ,換算成校準不確度為:0. 04/60. 5 =0. 0164 mL V T 4 =12. 36 mL V 0 =0. 35 mL 溫度不確定度分別為: 12. 36×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 006 0 mL 0. 35×2. 1×10 -4 ×4/30. 5 =0. 000 2mL 上述標準不確定度分量合成得: u (V T 4)=( 0. 016 42 +0. 006 02) 0.5 =0. 0175 mL u (V 0)=( 0. 016 42 +0. 000 22) 0. 5 =0. 016 4 mL u (V T 4 -V 0)=( 0. 017 52 +0. 01642) 0.5 =0. 0240 mL

3. 2. 7　測定非蛋白氮稀釋樣品(V N 1 / V N 2 ) 引入的 不確定度 u(V N 1 / V N 2) 由《常用玻璃量器檢定規程》可知, A級 2. 0 mL 移液管和 A級 20 mL容量瓶的允許偏差分別為 ±0. 010和 ±0. 02 mL [ 2 ] ,近似于三角形分布[3] ,換 算成校準不確定度分別為: 0. 010/60. 5 =0. 004 1 mL 0. 02/60. 5 =0. 0082 mL 溫度不確定度分別為: 2. 0×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 00097mL 20×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 009 7 mL 由上述不確定度分量合成得: u (V N 1)=( 0. 00412 +0. 000972) 0.5 =0. 0042 mL; u (V N 2)=( 0. 00822 +0. 00972) 0. 5 =0. 0127 mL; u (V N 1 /V N2)= [ ( 0. 0042/2. 0) 2 +( 0. 0127/20) 2] 0. 5 ×0. 1= 0. 000 22

3. 2. 8　滴定非蛋白氮吸取樣品(V N 3) 引入的不確定 度 u (V N 3) u (V N3) 即由 5. 0 mL移液管引入的不確定度。 由《常用玻璃量器檢定規程》可知, A級 5. 0 mL移 液管的允許偏差為 ±0. 015 mL [ 2] ,近似于三角形分 布[ 3] ,換算成校準不確定度為: 0. 015/60. 5 =0. 006 2 mL溫度不確定度為:
5. 0×2. 1×10-4 ×4/3 0. 5 =0. 002 4mL 由上述不確定度分量合成得: u(V N3)=( 0. 006 22 +0. 002 42) 0. 5 =0. 006 6 mL

3. 2. 9　滴定非蛋白氮實際消耗硫酸滴定液的體積 (V N 4 -V 0) 引入的不確定度 u (V N 4 -V 0) 1) 肉眼判斷終點所引入的不確定度已被包含 在測量重復性引入的標準不確定度 u(r e p) 中,在此 處不再考慮。2) 滴定管引入的標準不確定度: 查標 準得 25. 0 mL的 A級滴定管其最大容量的允許偏 差為 ±0. 04 mL [ 2 ] ,近似于三角形分布[ 3 ] ,換算成校 準不確度為: 0. 04/60. 5 =0. 016 4 mL V N 4 =6. 15 mL V 0 =0. 35mL 溫度不確定度分別為: 6. 15×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 003 0 mL 0. 35×2. 1×10-4 ×4/30. 5 =0. 000 2 mL 上述標準不確定度分量合成得: u(V N4)=( 0. 016 42 +0. 003 02) 0. 5 =0. 016 7 mL u(V 0)=( 0. 01642 +0. 00022) 0. 5 =0. 0164 mL u(V N 4 -V 0)=( 0. 016 72 +0. 01642) 0. 5 =0. 023 4mL

3. 3　不確定分量及各分量分析 在不確定度表達式中,假如 y(x 1, x 2, …, x i) 對 x i 是線性或與 x i 相比其 u (x i) 較小,偏導( y / x ) 可 近似為: y / x ≈{y [ x i+u(x i) ] -y(x i )} /u (x i ) 將 u (x i) 計入,獲得因 x i 不確定度引起的 y的不 確定度 u(y , x i) [ 4] ,即: u(y , x i)≈y {x 1, x 2…[x i+u (x i ) ]…x n}-y (x 1, x 2, …, x i , …, x n) 根據上式,由各不確定分量 u( x i) 進行計算可得到 對應的 u ( y , x i) ,結果見表 2。

3. 4　合成標準不確定度及擴展不確定度的計算 根據表 2結果,可得合成標準不確定度(u c) 為: u c= ∑ n i=1 u 2(y , x i )=0. 62% 擴展不確定度(U) 的計算公式為: U=k ·u c 置信因子(k ) 取 2,即置信概率為 95%,可得: U=0. 62% ×2=1. 2% 故人血白蛋白中蛋白質含量 W(%) 可表示為 ( 104. 7±1. 2)%。 　

討論
根據小分量不確定度不足最大分量不確定度的 1/3時,小分量不確定度可以忽略不計的原則[ 4] ,由 以上的評定結果可看出,本方法測定結果的不確度 主要來源于 6個分量: 測定總氮稀釋樣品的不確定 度 u(V T 1/ V T 2 ) 、滴定總氮吸取樣品的不確定度 u (V T 3) 、測量重復性 u(r e p) 、標定硫酸滴定液濃度 的不確定度 u (C D) 、滴定總氮實際消耗硫酸滴定液 的不確定度 u (V T 4 -V 0) 、稀釋硫酸滴定液的不確定 度 u (V D 1 /V D 2) 。 在試驗中使用的玻璃儀器均為 A級,因此不能 通過提高儀器的精密度改善結果, 但可采取下述2個措施降低本方法的不確定度。 1) 使用較大規格的移液管。 u(V T 1 / V T 2 ) 與 u(V T 3)較大的原因是 1. 0 mL移液管引入的不確定 度明顯大于較大規格的移液管。故在使用本方法測 定樣品時,在樣品量允許的前提下,通過重新設計試 驗步驟,在吸取樣品時選用較大規格的移液管,將能 顯著降低 u (V T 1 /V T 2) 與 u (V T 3) 。 2) 使用合適的自動化儀器進行樣品消化及滴定, 同時規范試驗操作,嚴格控制試驗條件,將能有效控 制試驗過程中產生的隨機誤差,從而降低 u (r e p ) 。